ไวรอยด์

ลักษณะอาการผิดปกติที่เกิดจากเชื้อ Columnea latent viroid (CLVd) บนมะเขือเทศ ทำให้พืชเกิดอาการต้นเตี้ยแคระแกรนอย่างรุนแรง

ไวรอยด์ (อังกฤษ: Viroid) เป็นเชื้อสาเหตุโรคพืช (plant pathogen) ที่มีขนาดเล็กที่สุดเท่าที่มีรายงาน สมัยก่อนถูกจัดจำแนกไว้รวมกับไวรัส (virus) แต่ปัจจุบันถูกจัดจำแนกมาเป็นกลุ่มของตัวเองเนื่องจากความแตกต่างทางโครงสร้างและระดับอาร์เอ็นเอ

ไวรอยด์เป็นเชื้อสาเหตุโรคพืชที่มีขนาดเล็กที่สุดเท่าที่เคยมีรายงานซึ่งมีขนาดที่เล็กกว่าเชื้อไวรัสอีก นอกจากนี้ไวรอยด์ยังมีลักษณะพิเศษและแตกต่างจากเชื้อสาเหตุโรคชนิดอื่นๆ คือ โครงสร้างของไวรอยด์ (และไวรัส) ไม่ได้มีลักษณะเป็นเซลล์เหมือนสิ่งมีชีวิตชนิดอื่น กล่าวคือ ไม่มีเยื่อหุ้มเซลล์ (cell membrane) รวมถึงองค์ประกอบเซลล์ (cell organelle) ที่จำเป็นในขั้นพื้นฐานสำหรับสิ่งมีชีวิต เช่น ไรโบโซม (ribosome) ซึ่งมีหน้าที่ในการสังเคราะห์โปรตีนให้กับเซลล์สิ่งมีชีวิต ด้วยเหตุผลดังกล่าวทำให้โครงสร้างของเชื้อไวรอยด์ (และไวรัส) ถูกจัดจำแนกเป็น “อนุภาค” (particle) และเนื่องจากองค์ประกอบพื้นฐานที่ไม่เป็นเซลล์ของทั้งไวรอยด์และไวรัส จึงทำให้เชื้อทั้งสองชนิดมีคุณลักษณะเป็น “ปรสิตถาวร” (obligate parasite) ที่จะเพิ่มปริมาณตัวเอง, มีการก่อให้เกิดโรคหรือแสดงอาการผิดปกติ รวมถึงแสดงคุณสมบัติความเป็นสิ่งมีชีวิตได้ก็ต่อเมื่อเชื้อไวรอยด์และไวรัสนั้นจะต้องติดเชื้อ (infection) อยู่ภายในเซลล์เจ้าบ้าน (host cell) แล้วเท่านั้น หากอยู่ภายนอกเซลล์โฮสต์ไม่ว่าจะเป็นพื้นผิววัสดุต่างๆ หรือในสิ่งแวดล้อม ไวรอยด์ (และไวรัส) จะไม่มีกิจกรรมหรือแสดงคุณสมบัติของความเป็นสิ่งมีชีวิตอยู่เลยแม้แต่น้อย ซึ่งต่างจากเชื้อสาเหตุโรคชนิดอื่นๆ (เชื้อรา, แบคทีเรีย, ไฟโตพลาสมา, โปรโตซัว และไส้เดือนฝอย)

องค์ประกอบ

เชื้อไวรอยด์มีองค์ประกอบเพียงเส้นอาร์เอ็นเอสายเดี่ยว (ssRNA) ที่เป็นวงปิด มีขนาดตั้งแต่ 296-463 เบส (base) โดยไม่มีโปรตีน (coat protein) ห่อหุ้ม (ซึ่งแตกต่างจากเชื้อไวรัสที่จะมีโปรตีนห่อหุ้มสารพันธุกรรมของตัวเองรวมถึงอาจมี envelop หุ้มอีกชั้นในเชื้อไวรัสสัตว์) โดยเทียบได้ว่าไวรอยด์มีขนาดจีโนม (genome) ที่เล็กมากที่สุดเท่าที่เคยมีรายงานซึ่งเล็กกว่าไวรัสชนิดที่เล็กที่สุดด้วยซ้ำ (ประมาณ 2,000 base) เนื่องจากลำดับเบสภายในจีโนมของไวรอยด์มีลักษณะเป็น “self-complementary base-pair” คือมีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่สามารถสร้างพันธะ hydrogen bond แบบจับกันเองภายในจีนโนมได้สูง จนทำให้จีโนมของไวรอยด์ที่เป็นวงอาร์เอ็นเอเกิดโครงสร้างทุติยภูมิ (secondary structure) ที่มีลักษณะคล้ายกับไม้เท้าหรือเหมือนวงหนังยางที่ถูกบิดเป็นเกลียว ที่เรียกว่า “rod-like structure” ในไวรอยด์วงศ์ Pospiviroidae หรือเป็น branched structure ในไวรอยด์ในวงศ์ Avsunviroidae นอกจากนี้แล้วไวรอยด์ยังเป็นสิ่งมีชีวิตเพียงชนิดเดียวที่ไม่สามารถสังเคราะห์โปรตีนได้เหมือนสิ่งมีชีวิตชนิดอื่น

โครงสร้างของเชื้อไวรอยด์

ไวรอยด์เป็นเชื้อสาเหตุโรคพืชที่สำคัญชนิดหนึ่ง มีองค์ประกอบเป็นอาร์เอ็นเอสายเดี่ยวที่เป็นวงปิดไม่มีโปรตีนห่อหุ้ม มีขนาดตั้งแต่ 246-399 เบส โดยปกติแล้วอาร์เอ็นเอไวรอยด์จะอยู่ในสภาพโครงสร้างทุติยภูมิที่มีลักษณะเป็น rod-shape (ภาพด้านล่าง) เนื่องจากการเกิดจับกันของเบสในสายอาร์เอ็นเอของเชื้อไวรอยด์ด้วยพันธะไฮโดรเจน ซึ่งเป็นโครงสร้างที่มีความเสถียรมากที่สุด ไวรอยด์เป็นเชื้อปรสิตถาวรในพืชที่ไม่สามารถสังเคราะห์โปรตีนได้ การเพิ่มปริมาณ การเคลื่อนย้าย และการทำให้อาการผิดปกติจะใช้โปรตีนและสารเคมีต่าง ๆ จากพืชอาศัย โครงสร้างของเชื้อไวรอยด์ประกอบไปด้วย 5 domain ได้แก่

1 Conserved central domain (C domain) ประกอบไปด้วยนิวคลีโอไทด์ประมาณ 95 เบส ซึ่งมีลักษณะอนุรักษ์สูง พบว่าบริเวณดังกล่าวจะเป็นบริเวณที่เกี่ยวข้องกับการเพิ่มปริมาณอาร์เอ็นเอของไวรอยด์เพื่อสร้างไวรอยด์รุ่นลูก

2 Pathogenicity domain (P domain) เป็นบริเวณที่มีบทบาทเกี่ยวกับการทำให้พืชเป็นโรค และการแสดงอาการที่รุนแรงในการทำให้เกิดโรคของเชื้อไวรอยด์ P domain เป็นบริเวณที่ทำให้เกิดความแตกต่างของลักษณะอาการของโรคที่เกิดจากเชื้อ PSTVd เมื่อมีการเปลี่ยนแปลงลำดับเบสทำให้ลักษณะอาการของโรคเปลี่ยนไป

3 Variable domain (V domain) เป็นบริเวณที่มีความแปรผันของลำดับเบสมากที่สุด โดยมีระดับความเหมือนกันของบริเวณ V domain ของเชื้อที่มีความใกล้ชิดกันน้อยกว่า 50 เปอร์เซ็นต์

4 Terminal domains (T domains) เป็นบริเวณปลายทั้ง 2 ด้านของโครงสร้างไวรอยด์ มีลักษณะเป็นเบสที่อนุรักษ์ในไวรอยด์กลุ่ม PSTVd

การเพิ่มปริมาณของเชื้อ

การเพิ่มปริมาณของเชื้อไวรอยด์จะอาศัยกระบวนการ rolling circle ซึ่งทำให้แยกไวรอยด์ออกเป็น 2 กลุ่มใหญ่ ๆ ได้ตามลักษณะของกระบวนการจำลองตัวเอง และบริเวณที่เกิดการจำลองตัว คือ

1. พวกที่มีการจำลองตัวแบบ symmetric cycle กระบวนการนี้ เชื้อไวรอยด์จะจำลอง อาร์เอ็นเอสายลบเส้นยาวจาก อาร์เอ็นเอสายเดี่ยววงกลมเส้นบวก จากนั้นเส้นอาร์เอ็นเอสายลบเส้นยาวจะเกิดกระบวนการ self cleaving ได้เป็น monomeric minus strand และเกิดกระบวนการ self ligation ได้เป็น minus circle monomer จากนั้นจะเกิดกระบวนการ rolling circle ขึ้นที่ minus circle monomer ได้เป็นอาร์เอ็นเอสายเดี่ยวเส้นบวกเส้นใหม่ และเกิดกระบวนการ self cleaving ตัดตัวเองให้ได้เป็น monomeric plus strand แล้วเกิดกระบวนการ self ligation ได้เป็นไวรอยด์ที่สมบูรณ์ กระบวนการดังกล่าวจะเกิดขึ้นที่คลอโรพลาสต์ ตัวอย่างไวรอยด์ในกลุ่มนี้ได้แก่ Avocado sunblotch viroid (ASBVd) Peach latent mosaic viroid (PLMVd) และ Chrysanthemum chlorotic mottle viroid (CChMVd)

2. พวกที่มีการจำลองตัวแบบ asymmetric cycle กระบวนการนี้ เชื้อไวรอยด์จะจำลองอาร์เอ็นเอสายลบเส้นยาวจาก อาร์เอ็นเอสายเดี่ยววงกลมเส้นบวก จากนั้นจะจำลองอาร์เอ็นเอสายเดี่ยวเส้นบวกเส้นใหม่ และจะเกิดกระบวนการ self cleaving ในการตัดตัวเองให้ได้เป็น monomeric plus strand แล้วเกิดกระบวนการ self ligation ได้เป็นไวรอยด์ที่สมบูรณ์ กระบวนการดังกล่าวจะเกิดขึ้นที่นิวเคลียสของเซลล์ ตัวอย่างไวรอยด์ในกลุ่มนี้ได้แก่ Potato spindle tuber viroid (PSTVd) Citrus exocortis viroid (CEVd) Hop stunt viroid (HSVd) และ Coconut cadang-cadang viroid (CCCVd) เป็นต้น

การจัดจำแนก

ปัจจุบันเชื้อไวรอยด์ถูกจัดจำแนกออกมามากกว่า 30 species โดยองค์กรกลุ่มคณะกรรมการ “International Committee on Virus Taxonomy (ICTV)” เป็นผู้ดำเนินการในการจัดจำแนกและจัดลำดับอนุกรมวิธานของเชื้อไวรัสและไวรอยด์ทุกสายพันธุ์ ทั้งที่เป็นเชื้อสาเหตุโรคในคน, สัตว์มีกระดูกสันหลัง, สัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง, พืช, เชื้อรา, สิ่งมีชีวิตเซลล์เดียว และ แบคทีเรีย รวมถึง พรีออน (prion) ด้วย

โดย ICTV ได้จัดจำแนกไวรอยด์ออกเป็น 2 วงศ์ (family) คือ Avsunviroidae (ออกเสียงว่า “เอฟซันไวรอยดีย์”) และ Pospiviroidae (ออกเสียงว่า “โพ-สปิไวรอยดีย์”) ตามคุณสมบัติต่างดังต่อไปนี้; ลักษณะโครงสร้างทุตยภูมิของเชื้อ, การปรากฎหรือไม่ของ central conserved region และ hammerhead ribozyme activity, องค์ประกอบเซลล์พืชที่ไวรอยด์ใช้ในการเพิ่มปริมาณ, กลไกการเพิ่มปริมาณและเอ็นไซม์ที่เกี่ยวข้อง, Host range หรือชนิดของพืชอาศัย (ตารางที่ 1) โดยวงศ์ Avsunviroidae จะถูกจำแนกออกเป็น 3 สกุล (genus) ได้แก่ Avsunviroid, Pelamoviroid และ Elaviroid ในขณะที่วงศ์ Pospiviroidae ถูกจัดจำแนกออกเป็น 5 สกุล ได้แก่ Pospiviroid, Hostuviroid, Cocadviroid, Apscaviroid และ Coleviroid (ตารางที่ 2)

ไวรอยด์ในวงศ์ Avsunviroidae มีโครงสร้างที่แตกต่างจากวงศ์ Pospiviroidae เนื่องจากไม่มีบริเวณ central conserved region ซึ่งเป็นลำดับเบสอนุรักษ์ที่จะปรากฎอยู่บริเวณกลางจีโนม ทำให้ลักษณะโครงสร้างทุติยภูมิมีความแตกต่างจากวงศ์ Pospiviroidae นอกจากนี้ไวรอยด์ในวงศ์ Avsunviroidae จะเพิ่มปริมาณเชื้อในคลอโรพลาสต์ (chloroplast) ของพืชอาศัยด้วยกลไกที่เรียกว่า “symmetric rolling-circle mechanism” โดยจะอาศัยโปรตีนและเอ็นไซม์ส่วนใหญ่จากคลอโรพลาสต์ โดยทั่วไปแล้วจำนวนชนิดพืชอาศัยของไวรอยด์ในวงศ์นี้ค่อนข้างแคบมาก (ตารางที่ 1)

ในขณะที่ไวรอยด์ในวงศ์ Pospiviroidae จะมีโครงสร้างทุติยภูมิเป็นแบบ “rod-like structure” โดยมีลำดับเบสอนุรักษ์ที่เรียกว่า “central conserved region” ปรากฎอยู่บริเวณกลางจีโนม ไวรอยด์ในวงศ์นี้จะเพิ่มปริมาณเชื้อในบริเวณนิวเคลียสของเซลล์พืชโดยจะอาศัยโปรตีนและเอ็นไซม์ที่อยู่ในนิวเคลียสด้วยกลไกที่เรียกว่า “asymmetric rolling-circle mechanism” ชนิดพันธุ์ไวรอยด์ที่มีรายงานส่วนใหญ่จะเป็นสมาชิกในวงศ์นี้ นอกจากนี้จำนวนชนิดพืชอาศัยของไวรอยด์ในวงศ์นี้จะกว้างกว่าวงศ์ Avsunviroidae มาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในไวรอยด์ในสกุล Pospiviroid, Hostuviroid, Cocadviroid และ Apscaviroid (ตารางที่ 1)

ตารางที่ 1 คุณสมบัติเฉพาะที่ใช้สำหรับการจำแนกเชื้อไวรอยด์ (Tangkanchanapas 2021)

พืชอาศัยของเชื้อไวรอยด์

พืชอาศัยของเชื้อไวรอยด์มีความหลากหลายมาก โดยวงศ์ Avsunviroidae จะมีพืชอาศัยที่แคบกว่าวงศ์ Pospiviroidae มากซึ่งได้แก่ อโวกาโดและพืชชนิดใกล้เคียง เบญจมาส stone fruit (พลัม แอปริคอท เชอร์รี่ และ cinnamon) สาลี่ พืชในวงศ์ Rosaceae เป็นต้น สำหรับเชื้อไวรอยด์ในวงศ์ Pospiviroidae จะมีความหลายหลายของพืชอาศัยสูงมากตามชนิดของเชื้อ เช่น พืชในวงศ์ Cannabaceae (เช่น hop) Palmae (เช่น มะพร้าว และปาล์ม) Solanaceae (เช่น มะเขือเทศ พริก มันฝรั่ง และยาสูบ) Lauraceae (เช่น อโวกาโดและอบเชย) Compositae (เช่น เบญจมาส แอสเตอร์ และทานตะวัน) Boraginaceae (เช่น ดอก forget-me-not) Campanulaceae Caryophyllaceae (เช่น คาร์เนชั่น) Convolvulaceae (เช่น ผักบุ้ง และ morning glory) Dipsaceae Sapindaceae (เช่น เงาะ ลำไย และ ลิ้นจี่) Scrophulariaceae Moraceae (เช่น หม่อน) Valerianaceae Rutaceae (เช่น ส้ม และ มะนาว) Rosaceae (เช่น แอปเปิล และ สาลี่) Vitaceae (เช่น องุ่น) Gesneriaceae Amaranthaceae (เช่น beet) Cucurbitaceae (เช่น แตงโม แตงกวา และเมลอน) และ Lamiaceae (เช่น โหระพา) นอกจากนี้ยังสามารถเข้าทำลาย แครอท turnip และ ถั่วปากอ้า

ลักษณะอาการของโรคที่เกิดจากเชื้อไวรอยด์

ลักษณะอาการที่เกิดจากเชื้อไวรอยด์ส่วนใหญ่จะคล้ายคลึงกับอาการที่เกิดจากเชื้อไวรัส คือ แคระแกร็น ใบ ก้านใบ และดอก ลดขนาด จนไปถึงไม่แสดงอาการผิดปกติ ขึ้นกับชนิดของเชื้อไวรอยด์และพืชอาศัย เช่น เชื้อ PSTVd ก่อให้เกิดอาการหัวมันบิดยาวแหลมในมันฝรั่ง, เชื้อ CEVd ก่อให้เกิดอาการต้นเตี้ยแคระแกร็น เปลือกลำต้นแตกร่อน และมีอาการใบหดลดรูปและเซลล์ตาย (necrosis) ในพืชกลุ่มส้ม, เชื้อ CCCVd ก่อให้เกิดอาการ chlorotic spot บนใบมะพร้าว ทำให้ผลที่ได้มีขนาดเล็กลง และทำให้พืชตายในที่สุด, เชื้อ Columnea latent viroid (CLVd) ก่อให้เกิดอาการต้นเตี้ยแคระแกร็น ใบเหลืองบิดม้วนและมีอาการเซลล์ตายที่เส้นใบ ก้านใบ และกิ่งในมะเขือเทศ, เชื้อ Chrysanthemum stunt viroid (CSVd) ก่อให้เกิดอาการ ต้นเตี้ยแคระแกร็น และดอกเล็กลีบในเบญจมาศ นอกจากนี้ยังมีไวรอยด์อีกหลายชนิดที่ไม่แสดงอาการผิดปกติในพืชอาศัย (latent) เช่น เชื้อ Hop latent viroid (HLVd) Coleus blumei viroid (CbVd) และ PLMVd โดยทั่วไปความรุนแรงของอาการจะขึ้นกับสภาพภูมิอากาศ ไวรอยด์จะแสดงอาการของโรคในช่วงอุณหภูมิที่สูงกว่า 20 องศาเซลเซียส และจะแสดงอาการที่รุนแรงและชัดเจนเมื่ออุณหภูมิสูงขึ้น

• 
  อาการ necrosis (เซลล์ตาย) ตามก้านและเส้นใบที่เกิดจากเชื้อ Columnea latent viroid บนมะเขือเทศ

• 
  อาการผลลดขนาดในมะเขือเทศที่เกิดจากเชื้อ Columnea latent viroid

• 
  อาการใบจุดเหลืองที่เกิดจากเชื้อ Grapevine yellow speckle viroid บนใบองุ่น

• 
  ลักษณะอาการผิดปกติของมะอึก (Solanum stramonifolium Jacq.) ที่เกิดจากการเข้าทำลายของเชื้อ Columnea latent viroid ทำให้พืชแคระแกรนอย่างรุนแรง

• 
  ภาพแสดงอาการผิดปกติจากเชื้อ Columnea latent viroid บนพริก ก่อให้เกิดอาการ necrosis ที่บริเวณเส้นใบและก้านใบ

ความเสียหายทางเศรษฐกิจ

ความเสียหายทางเศรษฐกิจและผลกระทบที่เกิดจากเชื้อไวรอยด์ขึ้นกับมูลค่าทางเศรษฐกิจของพืชนั้น ๆ ทั้งในแง่ปริมาณการผลิต ขนาด คุณภาพ และความสามารถทางการค้าในตลาด ตัวอย่างเช่น เชื้อ PSTVd ทำให้ผลผลิตมันฝรั่งลดลงถึง 64 เปอร์เซ็นต์ และมะเขือเทศลดลง 45 เปอร์เซ็นต์ เชื้อ HSVd ทำให้ผลผลิตมะเขือเทศลดลงถึง 43 เปอร์เซ็นต์ และ hop ลดลงมากกว่า 50 เปอร์เซ็นต์ เชื้อ CLVd ทำให้ผลผลิตมะเขือเทศลดลงถึง 50 เปอร์เซ็นต์ และเชื้อ CCCVd ทำให้ผลผลิตมะพร้าวลดลงถึง 22,000 ตันต่อปี นอกจากนี้เชื้อไวรอยด์ยังมีผลกระทบต่อการกักกันพืชซึ่งอาจทำให้ถูกกีดกันทางการค้าอีกด้วย

การถ่ายทอดโรค

การถ่ายทอดโรคของเชื้อ พบว่าเชื้อไวรอยด์เกือบทั้งหมดถ่ายทอดโรคโดยวิธีกลเป็นหลัก เช่นการปนเปื้อนของเครื่องมือและเครื่องจักรกลการเกษตร รวมถึงการติดตา ต่อกิ่ง ไวรอยด์หลายชนิดสามารถถ่ายทอดโรคผ่านทางเมล็ดพันธุ์และละอองเกสรได้ เช่น เชื้อ PSTVd CbVd HSVd GYSVd (Grapevine yellow speckle viroid) ASBVd และ CLVd นอกจากนี้ไวรอยด์บางชนิดยังสามารถถ่ายทอดโรคผ่านทางเพลี้ยอ่อนได้ เช่น PSTVd TPMVd (Tomato planta macho viroid) และ TASVd (Tomato apical stunt viroid)

การควบคุมโรค

การควบคุมโรคของเชื้อไวรอยด์ ปัจจุบันยังไม่มีสารเคมีที่สามารถนำมาใช้ควบคุมโรคอย่างได้ผล รวมถึงไม่มีพันธุ์ต้านทานโรค หรือแม้กระทั่งการผลิตพืชตัดต่อสารพันธุกรรม (transgenic plant) ให้มีความสามารถในการต้านทานโรคได้ ดังนั้นวิธีการที่ได้ผลดีที่สุดคือการจัดการแปลงที่ดี การใช้สารละลาย sodium hypochlorite (NaClO) ความเข้มข้น 1-3 เปอร์เซ็นต์ ล้างทำความสะอาดเครื่องมือและเครื่องจักรกลการเกษตรเพื่อป้องกันการปนเปื้อนของเชื้อ เป็นต้น

วิธีการตรวจวินิจฉัย

วิธีการตรวจวินิจฉัยเชื้อไวรอยด์ที่ใช้กันอยู่ในปัจจุบันมี 4 วิธี ได้แก่

1. Biological indexing หรือการใช้พืชทดสอบ เป็นวิธีการเริ่มแรกที่ใช้ในงานตรวจวินิจฉัยโรคพืชที่มีสาเหตุจากเชื้อไวรอยด์ เป็นวิธีการที่ง่ายแต่ไม่สามารถใช้ตรวจจำแนกได้ครอบคลุมทั้งหมด จะต้องใช้เทคนิควิธีการอื่น ๆ ร่วมเช่น RT-PCR หรือ Molecular Hybridization โดยเริ่มต้นจากการปลูกเชื้อบนพืชทดสอบที่เหมาะสมด้วยวิธีกล เช่น การการเสียบกิ่ง การใช้มีดทำให้เกิดแผล การทาใบพืชด้วยน้ำคั้นพืช (บดตัวอย่างพืชด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 9.0) จากนั้นนำพืชทดสอบมาปลูกไว้ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เพื่อสังเกตอาการที่ปรากฏ พืชทดสอบที่นิยมใช้ได้แก่ citron (Citrus medica) แตงกวา chrysanthemum morifolium Gynura aurantiaca มะเขือเทศพันธุ์ Rutgers โดยจะต้องเลือกใช้ให้เหมาะสมชนิดของเชื้อที่ต้องการตรวจสอบ ข้อเสียที่สำคัญของวิธีการนี้คือ ต้องใช้พืชทดสอบหลาย ๆ ชนิดในการตรวจสอบชนิดของเชื้อไวรอยด์ ซึ่งไม่เหมาะสมสำหรับการตรวจตัวอย่างปริมาณมาก เนื่องจากต้องใช้พื้นที่โรงเรือนมากและสิ้นเปลืองแรงงานสูง นอกจากนี้ยังกินเวลาในการรอให้พืชทดสอบแสดงอาการตั้งแต่ 2 อาทิตย์ จนถึงหลายเดือน แต่อย่างไรก็ตามวิธีการนี้ไม่สามารถนำมาใช้กับไวรอยด์บางชนิดได้ เช่น CCCVd และ CTiVd (Coconut tinangaja viroid) เนื่องจากไม่มีพืชทดสอบที่เหมาะสม และวิธีการปลูกเชื้อมีความยุ่งยาก ต้องใช้เครื่องมือที่มีแรงดันสูงในการปลูกเชื้อ รวมถึงระยะเวลาที่เชื้อแสดงอาการอาจกินเวลานานกว่า 4 ปี

2. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) โดยการทำ PAGE หนึ่งครั้งแล้วทำ PAGE ในสภาวะที่อาร์เอ็นเอเสียสภาพอีกครั้งหนึ่ง เพื่อแยกอาร์เอ็นเอไวรอยด์ออกจากอาร์เอ็นเอของพืช วิธีการนี้สามารถจำแนกย่อยได้เป็น 2 เทคนิค ตามวิธีการในการทำ PAGE ครั้งที่ 2 คือ S-PAGE (S = sequential) และ R-PAGE (R = return) โดย S-PAGE จะทำการ run PAGE ของอาร์เอ็นเอตัวอย่างในสภาวะปกติก่อนประมาณครึ่งหนึ่งของความยาวเจล จากนั้นจะ run PAGE ในสภาวะที่อาร์เอ็นเอเสียสภาพต่อจนจบ ส่วนวิธีการ R-PAGE จะทำการ run PAGE ของอาร์เอ็นเอตัวอย่างในสภาวะปกติจนสุดความยาวเจล จากนั้นจะทำการกลับเจลและ run PAGE ในสภาวะที่อาร์เอ็นเอเสียสภาพต่อสิ้นสุดความยาวเจล วิธีการนี้ถูกนำมาใช้มากในกรณีที่ใช้ตรวจสอบเชื้อไวรอยด์ที่ไม่ทราบชนิด แต่อย่างไรก็ตามวิธีการนี้มีความไวในการตรวจสอบต่ำกว่าวิธีการอื่น ๆ

3. Molecular Hybridization เป็นการอาศัยความสามารถในการเกิดปฏิกิริยาที่จำเพาะระหว่างเบส (A กับ U และ C กับ G) ของเชื้อไวรอยด์กับอาร์เอ็นเอหรือดีเอ็นเอตัวตรวจที่เรียกว่า probe ซึ่ง probe มีลำดับเบสคู่สมกับเชื้อไวรอยด์ที่ต้องการจะตรวจ และ probe ดังกล่าวจะถูกเชื่อมต่อกับสารเคมีหรือสารกัมมันตรังสีที่ช่วยให้สามารถตรวจติดตามได้ ปัจจุบันวิธีการ Molecular Hybridization เป็นวิธีการที่มีความสำคัญมากในงานวิจัยทางด้านไวรอยด์ รวมถึงงานตรวจรับรองการปลอดโรคและงานด้านกักกันพืช เนื่องจากมีความถูกต้องแม่นยำสูง กินเวลาน้อย และสามารถตรวจตัวอย่างได้คราวละมาก ๆ

4. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) ในการตรวจวินิจฉัยเชื้อไวรอยด์จำเป็นต้องทำปฏิกิริยา reverse transcription (RT) ก่อนเพื่อสร้างสาย cDNA (c = complementary) ก่อน แล้วตามด้วยปฏิกิริยา PCR เทคนิคนี้เป็นวิธีการที่มีความไวมากกว่าเทคนิค Molecular Hybridization ที่ใช้ cRNA probe 10 ถึง 100 เท่า และมากกว่าเทคนิค R-PAGE ถึง 2,500 เท่า สิ่งสำคัญในขั้นตอนปฏิกิริยา PCR คือต้องมีคู่ไพรเมอร์ที่จำเพาะกับเชื้อไวรอยด์ วิธีการ PCR เป็นวิธีการที่ให้ผลการตรวจที่รวดเร็วและมีความไวสูง สามารถตรวจสอบเชื้อไวรอยด์ได้แม้ว่าจะมีเชื้อในปริมาณที่ต่ำ

ตัวอย่างเชื้อไวรอยด์ที่สำคัญ

เชื้อไวรอยด์ที่สำคัญ

1. Chrysanthemum stunt viroid (CSVd) พบครั้งแรกที่สหรัฐอเมริกาในปี 1945 (Dimock, 1947) และในช่วงทศวรรษที่ 50 เชื้อแพร่ระบาดอย่างรวดเร็วไปยังแคนาดาและทั่วโลกที่มีการปลูกพืชวงศ์ chrysanthemum เนื่องจากขนส่งเคลื่อนย้ายไม้ตัดดอก (Lawson, 1987) CSVd เป็นเชื้อโรคที่สำคัญกับพืชทั่วไปและไม้ดอกหลายชนิด ลักษณะอาการที่สำคัญคือ ต้นแคระแกร็น ใบเสียรูปร่าง ระบบรากลดลง ยอดเกสรซีดและเป็นหมัน ในพืชบางชนิดจะทำให้เกิดอาการแคระแกร็นอย่างรุนแรง ซึ่งทำให้ผลผลิตเสียหาย เชื้อนี้สามารถแพร่กระจายไปกับเศษใบไม้จากพืชที่เป็นโรค (Hollings and Stone, 1973) ทางกล และการต่อกิ่ง (Brierley and Smith, 1949) ไม่สามารถถ่ายทอดโรคโดยแมลง (Brierley and Smith, 1951) และพบว่าในมะเขือเทศ CSVd สามารถถ่ายทอดโรคผ่านทางเมล็ดและละอองเกสรได้ (Kryczynski et al., 1988) อุณหภูมิและความเข้มของแสงจะมีบทบาทสำคัญเกี่ยวกับการเพิ่มปริมาณของเชื้อในพืช โดยการแสดงออกและความรุนแรงของโรคขึ้นกับปริมาณของเชื้อที่พืชได้รับรวมกับอุณหภูมิ ความเข้มของแสง และระยะเวลาที่พืชได้รับแสง โดยที่สภาวะที่ทำให้พืชแสดงอาการโรคได้ดีที่สุดคือ ที่ความเข้มแสงสูง อุณหภูมิอยู่ระหว่าง 26 - 29°C (Handley and Horst, 1988) พบว่า เมื่อนำน้ำคั้นจากพืชเป็นโรคที่เก็บที่ 18°C นาน 7 สัปดาห์ ยังคงความสามารถทำให้พืชเกิดโรคได้ สามารถเจือจางเชื้อได้จนถึง 10-4 และพบว่ายังสามารถทำให้พืชเกิดโรคได้หลังจากที่ผ่านอุณหภูมิ 98°C นาน 10 นาที (Brierley, 1952; Hollings and Stone, 1973) และในสภาพที่เป็นเนื้อเยื่อแห้งที่เก็บนานอย่างน้อย 2 ปียังสามารถทำให้พืชเกิดโรคได้ (Keller, 1953) เชื้อชนิดนี้ไม่สามารถกำจัดโดยวิธีการ heat treatment ได้ การป้องกันทำโดยการแช่วัสดุอุปกรณ์ต่าง ๆ ในสารละลาย 2% trisodium orthophosphate (TSP) หรือ 2% formaldehyde หรือล้างมือใน 2% trisodium orthophosphate (TSP) ก่อนการตัดกิ่ง (Hollings and Stone, 1973)

2. Citrus exocortis viroid (CEVd) ลักษณะอาการที่สำคัญในมะเขือเทศคือจะมีอาการใบหงิกย่นม้วนลงและลดรูป ลำต้นเตี้ยแคระแกร็น ขนาดของผลลดลง ไวรอยด์ส่วนใหญ่มักจะอยู่ที่บริเวณเนื้อเยื่อ phloem ที่ยังเป็นเซลล์อ่อนอยู่ ส่วนใหญ่การกระจายของเชื้อจะกระจายในทิศทางสู่ยอดของลำต้น (Semancik et al., 1978; Baksh et al., 1983) ไวรอยด์ชนิดนี้อาศัยและเพิ่มปริมาณอยู่ในนิวเคลียสของเซลล์พืช (Semancik et al., 1976) และอาศัย host RNA polymerase II ในการเพิ่มปริมาณ (Warrilow and Symons, 1999) การแพร่กระจายของเชื้อจะแพร่กระจายโดยทางกล เช่น อุปกรณ์ในการตัดแต่งกิ่ง มีด กรรไกร

3. Columnea latent viroid (CLVd) ถูกค้นพบโดยการนำสารพันธุกรรมที่เตรียมได้จากใบที่ไม่แสดงอาการโรคของ Columnea erythrophea ถ่ายทอดไปยังมะเขือเทศสายพันธุ์ Rutgers โดยอาการของโรคที่แสดงออกในมะเขือเทศสายพันธุ์ Rutgers จะมีความคล้ายคลึงกับ PSTVd แต่อาการจะไม่รุนแรงเท่า PSTVd สายพันธุ์รุนแรง (Owen et al., 1978) พบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์ส่วนใหญ่ของ CLVd จะมีความเหมือนกันกับไวรอยด์ในกลุ่ม PSTVd มาก แต่ลำดับนิวคลีโอไทด์ในบริเวณ central domain จะมีความเหมือนกับ HSVd นอกจากนี้เชื้อ CLVd สามารถก่อให้เกิดโรคได้ในมันฝรั่ง พืชในวงศ์ Cucurbitaceae และ Gynura aurantiaca

4. Cucumber pale fruit viroid (CPFVd) Sanger et al. (1976) พบว่าเชื้อ CPFVd สามารถทำให้เกิดโรคในมะเขือเทศได้ นอกเหนือจากพืชในวงศ์ Cucurbitaceae

5. Hop stunt viroid (HSVd) เป็นโรคที่มีความสำคัญใน hop สามารถติดโรคได้ในพืชในวงศ์ Cucurbitaceae องุ่น Solanaceae และ Moraceae ลักษณะอาการที่สำคัญคือทำให้พืชเกิดอาการเตี้ยแคระแกร็น ก้านใบสั้น ใบม้วนเหลือง ในมะเขือเทศพบว่าโรคนี้สามารถถ่ายทอดโรคได้โดยทางกลแต่ไม่สามารถถ่ายทอดโรคได้ทางเมล็ด (Sano and Shikata, 1988)

6. Mexican papita viroid (MPVd) แยกเชื้อได้จากพืช Solanum cardiophyllum Lindl. พบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์ของ MPVd มีความใกล้เคียงกันกับ TPMVd และ PSTVd

7. Potato spindle tuber viroid (PSTVd) ก่อให้เกิดโรคในมะเขือเทศโดยใช้เวลาในการพัฒนาอาการ 4 - 5 สัปดาห์ หลังจากพืชได้รับเชื้อ ลักษณะอาการที่สำคัญ จะทำให้ผลมีขนาดเล็กลง เปอร์เซ็นต์ความงอกลดลง 24 - 48 เปอร์เซ็นต์ (Benson and Singh, 1964) ใบหงิกย่นโค้งลง ลดรูป และมีอาการใบเหลืองและม่วง ก้านใบหดลดขนาด เกิดอาการเซลล์ตายและต้นเตี้ยแคระแกร็น (Fernow et al., 1969) ในมันฝรั่งพบว่ามีการแตกพุ่มของตาข้าง ผลมีขนาดเล็กลง บิดยาว มีรูปร่างเหมือน dumb-bell ใบหงิกย่นโค้งลงและลดรูป นอกจากนี้ PSTVd ยังทำให้ผลผลิตของมันฝรั่งลดลง ซึ่งจะขึ้นกับชนิดพันธุ์ของมันฝรั่ง ความรุนแรงของเชื้อ และช่วงระยะเวลาที่มันฝรั่งได้รับเชื้อ (Pfannenstiel and Slack, 1980) พบว่าถ้าเป็นเชื้อสายพันธุ์ที่รุนแรงจะทำให้ผลผลิตลดลงมากกว่า 64 เปอร์เซ็นต์ ไวรอยด์ชนิดนี้สามารถถ่ายทอดโรคได้ทั้งทางเมล็ดและละอองเกสร ทั้งในมะเขือเทศและมันฝรั่ง (Benson and Singh, 1964; Hunter et al., 1969; Singh, 1970) และสามารถถ่ายทอดโรคผ่านทางกลได้ง่าย PSTVd สามารถติดเชื้อได้ทั่วทุกส่วนของพืช (Diener, 1987; Weidemann, 1987) ถึงแม้ว่า PSTVd มีการแพร่ระบาดไปเกือบทั่วโลก แต่จากข้อมูลในรายงานจาก European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO)

8. Tomato apical stunt viroid (TASVd) พบการระบาดครั้งแรกใน Ivory Coast และ อินโดนีเซีย มีการรายงานว่าระบาดร้ายแรงใน อิสราเอล ลักษณะอาการที่สำคัญคือ ลำต้นข้อสั้น ใบเปลี่ยนเป็นสีเหลืองหดย่นและเสียรูปร่าง ขนาดผลลดลง สีผลซีด ทำให้ผลผลิตลดลงอย่างมาก การแพร่ระบาดของโรคเกิดโดยผ่านทางกลและการต่อกิ่ง ยังไม่มีข้อมูลเกี่ยวกับการถ่ายทอดโรคผ่านทางเมล็ดและทางละอองเกสร (Antignus et al., 2002)

9. Tomato bunchy top viroid (TBTVd) มีการรายงานครั้งแรกในประเทศแอฟริกาใต้ ลักษณะอาการมักจะขึ้นกับระยะการเจริญเติบโตของพืช (Diener, 1979) อาการโดยทั่วไปจะมีลักษณะคล้ายคลึงกับเชื้อ PSTVd (Raymer and O’ Brien, 1962) โดยอาการเริ่มแรกจะพบเนื้อเยื่อตายบริเวณเส้นใบ จากนั้นอาการจะขยายไปตามความยาวของเส้นใบและจะกระจายไปยังก้านใบและลำต้น นอกจากนี้ยังทำให้ใบมีลักษณะผิดรูปร่าง ใบม้วนและมีขนาดเล็กลง มะเขือเทศที่ได้รับเชื้อ TBTVd สามารถออกดอกและติดผลได้แต่ผลจะมีขนาดเล็ก มีรูปร่างที่ผิดปกติ และมีจำนวนเมล็ดภายในผลลดน้อยลง (Diener, 1979, 1987)

10. Tomato chlorotic dwarf viroid (TCDVd) ลักษณะอาการที่สำคัญของโรค คือเกิดอาการใบเหลืองอย่างฉับพลัน การเจริญลดลง ต้นเตี้ยแคระแกร็น ใบแสดงอาการเป็นยอดพุ่ม (Singh et al., 1999)

11. Tomato planta macho viroid (TPMVd) ลักษณะอาการที่สำคัญของโรคจะทำให้ต้นมะเขือเทศเตี้ยแคระแกร็นอย่างรุนแรง มักมีการแตกใบยอดและใบข้างจำนวนมาก ส่วนใบด้านล่างแสดงอาการเหลือง แห้ง และร่วง พบอาการเนื้อเยื่อตายบริเวณเส้นใบและก้าน มะเขือเทศที่ติดเชื้อนี้จะมีการออกดอกติดผลมากกว่าปกติ แต่ผลที่ได้จะมีขนาดเล็ก สามารถถ่ายทอดโรคสู่มะเขือเทศโดยมีเพลี้ยอ่อนเป็นพาหะ (Galindo et al., 1982)

อ้างอิง

• ปริเชษฐ์ ตั้งกาญจนภาสน์. 2548. การตรวจสอบเชื้อไวรอยด์ในแปลงผลิตเมล็ดพันธุ์มะเขือเทศในเขตภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทย. วิทยานิพนธ์ปริญญาโท, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์.
• ศศิประภา มาราช. 2551. โคลนก่อโรคของเชื้อ Columnea latent viroid และผลกระทบต่อมะเขือเทศพันธุ์การค้า. วิทยานิพนธ์. วิทยานิพนธ์ปริญญาโท, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์.
• Diener, T.O. 1987. The Viroids. Plenum Press, Inc., New York. 344 p.
• Hadidi, A., R. Flores, J.W. Randles and J.S. Semancik. 2003. Viroids. Science Pulishers, Inc., USA. P. 370.